膀胱内应用治疗药物400 500分上的医科大学可以治疗膀胱癌，但对肿瘤尿路上皮细胞的特异性靶向作用和药物的内吞途径尚不清楚。在癌变过程中，浅表尿路上皮细胞表现出顶端质膜上糖残基的变化。这可以用于选择性靶向膀胱管腔侧。本研究表明，植物凝集素Jacalin(来自Artocarpus integrifolia)、ACA(来自Amaranthus caudatus)和DSA(来自曼陀罗(Datura stramonium))在体外选择性结合低(RT4)和高(T24)癌尿路上皮细胞的顶端质膜，并在体外选择性结合尿路上皮肿瘤细胞。凝集素结合量在RT4和T24细胞间有显著差异。凝集素的内吞作用仅在癌性尿路上皮细胞中观察到，而在正常的尿路上皮细胞中没有观察到。在离体尿路上皮肿瘤细胞和RT4、T24细胞中可见充满凝集素的巨肽体、内体样囊泡和多泡体。体外添加巨噬细胞抑制剂5-(n -乙基- n -异丙基)酰胺(EIPA)后，Jacalin和ACA在癌细胞中的内吞作用降低，表皮生长因子(EGF)刺激巨噬细胞后，Jacalin和ACA的内吞作用增加。网格蛋白、小窝蛋白和flotillin不能与凝集素结合。这些结果证实了肿瘤尿路上皮细胞中凝集素内吞的主要机制是巨噬细胞作用。因此，我们建议凝集素与结合治疗药物联合使用是一种很有希望的工具，可以通过靶向癌细胞来改善膀胱内治疗。
尿路上皮是膀胱的层状上皮，是导致膀胱癌的癌转化的主要来源(Shin et al. 2014)。在健康膀胱中，高度分化的浅表伞状细胞表达大量的四种尿蛋白(UPIa、UPIb、UPII和UPIIIa)，它们在顶端质膜上形成尿路上皮斑块(Yu et al. 1994;Wu et al. 1994;Wu et al. 1990;Hudoklin et al. 2011;Kachar et al. 1999;Porter et al. 1967)。UPII没有糖基化，而UPIa、UPIb和UPIIIa都是用n链聚糖糖基化的(Yu et al. 1994;Wu and 广东交通职业技术学院分数线Sun 1993)。UPIa和UPIb分别被富含甘露糖的结构和复合聚糖糖基化(Xie et al. 2006)。UPIIIa含有由唾液酸在α(2,3)-和α(2,6)-与半乳糖(Gal)和Gal-α(1,3)-Gal链上覆盖的复合聚糖(Malagolini et al. 2000)。UP表达和糖基化谱在尿路上皮肿瘤前变化和早期尿路上皮癌发生期间发生改变，并在尿路上皮癌发生的后期下调(Zupancic 2013;Zupancic et al. 2020;Zupancic et al. 2011;Ogawa et al. 1999;Wu et al. 1998;zupan
膀胱癌分为非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)。NMIBC肿瘤局限于尿路上皮(低级别乳头状癌称为乳头瘤和Ta期)或侵犯尿路上皮以下的固有层(T1期)。mibc侵袭肌肉(T2期)或膀胱周围脂肪组织，有时也侵袭邻近器官(分别为T3期或T4期)。用于NMIBC (Ta期)的体外模型是低级别人尿路上皮乳头瘤细胞系RT4和用于MIBC (T2期)的高级别尿路上皮癌细胞系T24。尽管通过经尿道膀胱切除术(TURB)和膀胱内灌注丝裂霉素C或卡介苗(BCG)成功切除了NMIBC肿瘤，但复发率很高(50-70%)(rich et al. 2020)。大约20%的复发进展为MIBC，其转移风险高，预后差(Aragon-Ching et al. 2018)。尽管有许多新颖的实验方法，但在开发更有选择性的治疗方法以减少局部或全身副作用方面进展甚微。因此，更有针对性地将细胞毒性药物递送到癌细胞中，有利于避免药物毒性，提高药物疗效。对于膀胱癌，其中> 75%在初始诊断时为NMIBC (Kamat et al. 2016)，可以使用膀胱内途径靶向递送部位特异性药物，这些药物可以通过导管给药，以避免全身使用。
针对尿路上皮肿瘤靶向药物递送的各种策略正在进行深入研究(Zacchè等人，2015;Yoon et al. 2020;Heath and Rosenberg 2021)。其中，植物凝集素如WGA(小麦胚芽凝集素来自Triticum vulgaris)、Jacalin(来自Artocarpus integrifolia)、ACA(来自Amaranthus caudatus凝集素)和DSA(来自曼陀罗(Datura stramonium)凝集素)正在被研究，并被认为是一种有希望的选择性药物传递给膀胱癌细胞的方法，因为细胞表面的糖残基发生了变化(Neutsch et al. 2014, 2012, 2011, 2013;Plattner et al. 2008;Zupancic et al. 2014;Kreft et al. 2009b;Azevedo et al. 2017)。Jacalin和ACA对t抗原(Core1)和n抗原(α - n-乙酰半乳糖胺)结合的肽具有高亲和力，Jacalin也对Core3和唾液酰t (ST)结合的肽具有高亲和力(Tachibana et al. 2006)。DSA识别半乳糖(β-1,4) n -乙酰氨基葡萄糖低聚物，并且更喜欢壳聚糖或壳三糖而不是单一的n -乙酰氨基葡萄糖残基。我们之前已经在啮齿动物膀胱癌模型中证明了Jacalin、ACA和DSA对转化细胞具有特异性靶向作用。Jacalin和DSA可以区分正常和癌性尿路上皮细胞，而ACA在癌症进展过程中表现出差异结合(Zupancic et al. 2014)。
众所周知，来自不同类型肿瘤的癌细胞会吞噬大量的细胞外液、颗粒货物和具有特定糖残基的膜(Xiao et al. 2021)。我们已经证明，与高度分化的浅表尿路上皮细胞相比，低分化的尿路上皮细胞具有更高的内吞活性(Kreft et al. 2009b;Tratnjek et al. 2017;Lojk et al. 2018)。由于癌症的尿路上皮细胞和肿瘤的表面细胞没有达到终末分化，因此了解凝集素内吞作用的机制对于利用凝集素作为药物递送系统的靶向配体是很重要的。
为了研究凝集素的选择性靶向作用和内吞机制，选取了不同碳水化合物特异性的凝集素Jacalin、ACA和DSA。为了提高我们的结果的重要性，并使它们更接近泌尿外科的潜在临床应用，我们将体外的癌症尿路上皮细胞实验与体外的尿路上皮肿瘤实验结合起来。我们的研究结果表明，凝集素可以用于选择性靶向肿瘤的尿路上皮细胞，而肿瘤尿路上皮细胞的凝集素内吞作用的主要机制是巨噬细胞作用。
荆芥fitc偶联凝集素;FL-1151)和D. stramonium (DSA;FL-1181)购自Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)， fitc偶联凝集素来自A. caudatus (ACA;21,510,290)购自GlycoMatrix (Dublin, OH, USA)。胶体金偶联凝集素Jacalin-15 nm金(GP-6301-15)、ACA-10 nm金(GP-8201-10)和DSA-5 nm金(GP-5701-5)购自EY Laboratories (San Mateo, CA, USA)。凝集素抑制分子牛颌下粘蛋白(ACA)、半乳糖(jacalin)和几丁质水解物(DSA)也购自Vector Laboratories。兔多克隆抗uroplakin (UP)一抗是纽约大学医学院细胞生物学系孙东天教授(Wu et al. 1990)赠送的。还使用了以下兔多克隆抗体:抗flotillin (ab41927, Abcam)，抗网格蛋白(610,499,BD Transductions)，抗caveolin (ab18199, Abcam)和抗动力蛋白2 (ab65556, Abcam)。采用山羊抗兔IgG AlexaFluor 488 (A11008, Invitrogen)和山羊抗兔IgG AlexaFluor 555 (A21428, Invitrogen)二抗。含有DAPI(一种细胞核标记物)的Vectashield培养基从Vector Laboratories获得。
人膀胱癌细胞系RT4和T24 (ATTC, Manassas, VA)在添加5% FBS, 10,000 U/ml青霉素和10,000 μ g/ml链霉素(Gibco, Invitrogen, Vienna, Austria)的先进Dulbecco's Modified Eagle 's Medium (a - dmem)/F12培养基(1:1)中生长，37℃，含5% CO2的湿化气氛中生长。RT4和T24细胞(5 × 104个/cm2)培养1周后进行实验。根据《动物健康保护法》和《为科学目的授予动物实验许可证的指示》，斯洛文尼亚农业和林业部兽医管理局批准使用猪膀胱制备初级尿路上皮细胞。正常猪膀胱从当地屠宰场获得，正常猪尿路上皮细胞(NPU)的原代和二次培养在我们的实验室中进行，详见之前的描述(Vi?njar et al. 2017;Visnjar et al. 2012;Visnjar and Kreft 2013)。简单地说，从膀胱壁上刮取尿路上皮细胞，在含有MCDB153/A-DMEM(1:1)、2.5% FBS、0.1 mM磷酸乙醇胺、0.5μg/ml氢化可的松、5μg/ml胰岛素、4 mM谷氨酰胺、10,000 U/ml青霉素和10,000μg/ml链霉素的培养基中收集。原代和继代培养(2 × 105个细胞/cm2)在含有0.9 mM钙和2.5%胎牛血清(Gibco)的UroM培养基中培养，然后转移到含有2.7 mM钙和不含胎牛血清的UroM培养基中培养3周，以实现尿路上皮分化。这些二次培养物用于免疫标记和体外凝集素结合试验以及内吞分析。除非另有说明，培养基和培养基均购自Sigma (Taufkirchen, Germany)。
这项研究是根据1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案进行的，并得到斯洛文尼亚国家医学伦理委员会第101/11/14号的批准。研究人群包括10名在斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学中心泌尿外科接受TURB治疗的膀胱癌患者。在组织提取前获得所有患者的知情同意。
通过透射电子显微镜(TEM)、免疫电子显微镜和体外内吞凝集素分析，通过冷杯活检从每位患者身上获得尿路上皮肿瘤样本。为了进行免疫标记和凝集素结合试验，也在距肿瘤2cm处取正常尿路上皮。活组织检查显示尿路上皮和固有层。对于所有样本的病理分期和分级，病理学家(来自卢布尔雅那大学医学院病理研究所)使用了AJCC癌症分期手册(Amin et al. 2017)。尿路上皮癌诊断为乳头状瘤(1例)、非侵袭性低级别尿路上皮癌(3例)、侵袭性低级别尿路上皮癌(t1, l. g)(2例)、侵袭性尿路上皮癌(t1, h. g)(2例)、侵袭性尿路上皮癌(t1, h. g)和侵袭性尿路上皮癌(t2, h. g)。在10例膀胱镜检查正常的尿路上皮标本中，6例被归类为正常，因为组织病理学检查显示它们没有表现出增生或不典型增生的迹象。
在体外
为了分析凝集素结合，将NPU、RT4和T24细胞冷却至4°C，以非特异性抑制内吞作用。这一步骤确保了凝集素结合而无需内部化。用冰冷的PBS洗涤细胞，用fitc偶联凝集素(20 μg/ml)在4℃黑暗中孵育30 min。作为对照，凝集素与抑制分子结合。在与fitc结合的凝集素细胞孵育前，每个凝集素(20 μg/ml)与抑制分子在室温下黑暗孵育1小时。ACA用0.75 M的牛颌下粘蛋白，Jacalin用1.11 M的半乳糖，DSA用几丁质水解原液。然后将细胞与凝集素和抑制分子的偶联物在4°C黑暗中孵育30分钟。然后，用PBS洗涤细胞三次，并在活细胞中测量荧光，以确定凝集素的结合量。用4%甲醛在4°C下固定细胞15分钟，进行荧光显微镜观察和免疫标记。在活细胞中使用微孔板阅读器(Safire2, Tecan, Mannedorf, Switzerland)测量FITC的荧光强度，以确定凝集素的结合量。使用荧光显微镜(AxioImager Z.1，蔡司，德国)，用油浸物镜(63 ×油/NA 1.40)观察凝集素与根尖质膜的结合情况，并用apoome(蔡司)进行光学切片。凝集素与细胞结合的量以每次培养中绝对荧光强度(a.u)的平均值表示。测量至少在三个独立的实验中进行，每个实验有三个重复。
体外
活检标本与fitc偶联凝集素(20 μg/ml)在UroM培养基中孵育。在4°C的黑暗中孵育30分钟后，用PBS洗涤样品。然后将样品在4°C下4%甲醛中固定30分钟，用PBS洗涤，置于包埋介质(OCT, Tissue Tek, The Netherlands)中，并在液氮中冷冻。冷冻组织块垂直于尿路上皮管腔表面切割;制作7 μm连续切片，室温风干2 h。
为了可视化凝集素结合，每个样品的第一次冷冻切片用DAPI安装在Vectashield上，并用荧光显微镜(Eclipse TE300, Nikon, Japan)成像。每个活检样本的连续冷冻切片用于免疫标记。
在体外
将NPU、RT4和T24细胞在4℃下用4%甲醛固定15 min，然后用0.5% BSA、0.1%皂苷、0.1%明胶、50 mM NH4Cl和0.02% NaN3孵育30 min，以阻断非特异性标记。然后用抗up一抗(1:1000)孵育细胞。然后用PBS洗涤细胞，用AlexaFluor 555偶联的山羊抗兔IgG二抗(1:400)在37℃下孵育1小时。用DAPI将细胞置于Vectashield中，用荧光显微镜(AxioImager Z.1)对细胞进行成像。
体外
体外凝集素结合实验后获得的冷冻切片用PBS洗涤，并在PBS中加入5%胎牛血清(FCS)和1%牛血清蛋白，在37℃下预孵育1小时。然后，用1% BSA的抗up一抗(1:1000)在4°C的PBS中孵育过夜。对于阴性对照，省略一抗孵育或用非相关抗体代替特异性抗体。洗涤后，切片在室温下用AlexaFluor 555偶联的山羊抗兔IgG二抗(1:400)孵育1小时，PBS洗涤，用DAPI在Vectashield上固定。用荧光显微镜(Eclipse TE300)检查冷冻切片。
切片切成1 mm3块，室温下用2%甲醛和0.05%戊二醛固定1小时。样品分别在30%乙醇(0°C)、55%乙醇(- 15°C)、70%乙醇(- 30°C)和100%乙醇(- 50°C)中脱水，并在100% Lowicryl HM20 (Polysciences, Germany)中逐渐渗透。样品在紫外光下聚合。超薄切片被切割并收集在金网格上。非特异性标记用含有0.1%鱼明胶、0.8% BSA和5% FCS的PBS缓冲液阻断。然后用抗UPs一抗(1:5000)免疫定位UPs。用PBS洗涤后，用5 nm或10 nm金偶联的抗兔IgG二抗检测UPs (Jackson ImmunoResearch, Cambridgeshire, United Kingdom)。切片用PBS清洗，然后用蒸馏水清洗。5 nm金用intensive (Amersham, UK)镀银增强4分钟。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅反染(Merck, Darmstadt, Germany)。对于阴性对照，除省略一抗或用兔血清孵育切片外，其余方法相同。切片用透射电子显微镜(Philips CM100，荷兰)在80 kV下进行分析，并用AMT相机(Advanced Microscopy Techniques Corp.， Woburn, MA, USA)拍摄显微照片。
NPU、RT4和T24细胞在RIPA缓冲液(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)中裂解，并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂(100 × Halt Cocktail, Thermo Scientific, 78,441)。用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白浓度;每道5μg蛋白在4-20% Novex tris -甘氨酸凝胶(Thermo Scientific)上被负载并进行大小分离，然后转移到Hybond ECL硝化纤维素膜(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)上。将膜在含0.1%吐温-20 (Sigma)的5%脱脂干牛奶中阻断，室温下1小时，然后在4℃下与抗up一抗(1:5000;抗体与UPIIIa-47 kDa结合较强，与UPIa-27 kDa、UPIb-28 kDa和UPII-15 kDa结合较弱)，并与HRP偶联抗兔IgG二抗(Sigma, 1:1000)在室温下结合2小时。用Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce, Rockford, IL)剥离印迹，并与小鼠单克隆抗β-肌动蛋白一抗(A2228, 1:2000, Sigma)孵育，以确认相同的蛋白负载。用HRP结合的抗小鼠IgG二抗(Sigma, 1:1000)在室温下作用2小时。最后用化学发光底物(SuperSignal West Pico Plus, Thermo Fisher Scientific)探测膜。化学发光检测采用iBright FL1500成像系统(Thermo Fisher Scientific)。
体外免疫标记
为了研究漂浮蛋白、小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞作用，将NPU、RT4和T24细胞与fitc结合的凝集素在37℃下孵育1小时。在RT4和T24细胞中检测网格蛋白独立/动力蛋白依赖的内吞作用。用PBS洗涤细胞，在4℃下用4%甲醛PBS固定15分钟。用0.5% BSA、0.1%皂苷、0.1%明胶、50 mM NH4Cl和0.02% NaN3阻断30 min后，用兔抗flotillin多克隆抗体(1:200)、兔抗caveolin多克隆抗体(1:200)、小鼠抗clathrin单克隆抗体(1:200)和兔抗dynamin 2多克隆抗体(1:200)在37℃下孵育1 h。然后用PBS洗涤细胞，用alexafluor555偶联的抗兔IgG或抗小鼠IgG二抗(1:400)在37℃下孵育30分钟。细胞洗涤后，在vectashiled - dapi中裱片，用荧光显微镜(AxioImager Z.1)成像，并取光学切片(Apotom，蔡司)。
体外内吞试验
为了分析凝集素的巨噬作用，将RT4和T24细胞分别与fitc偶联的凝集素和0.5 mg/ml trtc偶联的低分子量葡聚糖(3 kDa, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)或0.5 mg/ml trtc偶联的高分子量葡聚糖(70 kDa, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)在37°C下孵育1小时。3 kDa和70 kDa的右旋糖酐都能够标记大肽体(Chen et al.厦门东海酒店 2018);70 kDa右旋糖酐主要通过网格蛋白和动力蛋白无关的和对氨酰胺敏感的巨量红细胞增多症进入细胞(Li et al. 2015)，使其成为巨量红细胞增多症的既定标志物(Commisso et al. 2013)。细胞用4%甲醛在4℃下固定15分钟，洗涤后包埋于vectasshield - dapi中。使用荧光显微镜(AxioImager Z.1)进行成像。
在T24和RT4细胞中加入100μM Dyngo (ab120689, Abcam)， 37°C孵育1 h，以抑制巨噬细胞作用。然后将细胞与fitc结合的凝集素或trtc结合的葡聚糖(3kda)以及EIPA或Dyngo在37℃下再孵育1小时。抑制剂的总孵育时间为2小时。采用相同的方案，用500 nM的EGF刺激巨噬细胞。对照细胞用EIPA、Dyngo、葡聚糖或EGF处理，只用fitc结合的凝集素孵育。孵育后，清洗细胞，使用微孔板读取仪(Safire2, Tecan, Mannedorf，瑞士)测量fitc偶联凝集素或trtc偶联葡聚糖荧光强度。细胞中凝集素的数量表示为处理后的平均荧光强度与对照细胞的平均荧光强度之比。用trtc -共轭葡聚糖(70 kDa)孵育的细胞在4℃下用4%甲醛固定15 min，在PBS中用16.7 μg/ml fitc -共轭phalloidin (Sigma, Germany)标记30 min，室温下。样品用DAPI包埋在Vectashield中。使用荧光显微镜(AxioImager Z.1)进行成像。
体外和离体内吞作用透射电镜分析
活检标本和RT4、T24细胞用金偶联凝集素(1 μg/ml)在37℃下孵育1 h。用PBS洗涤活检组织和细胞，用4%甲醛和2.5%戊二醛在0.鞍山科技大学是几本 1 M羧酸盐缓冲液中固定2.5 h，温度4℃。然后用0.33 M蔗糖在羧酸盐缓冲液中洗涤，并在室温下用1% OsO4固定1小时。然后将它们脱水并包埋在Epon (Serva，海德堡，德国)中。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。用透射电子显微镜(Philips CM100, 80kv)分析样品，用AMT相机(Advanced Microscopy Techniques Corp.， Woburn, MA, USA)拍摄显微照片。
使用Microsoft Excel和Graph Pad Prism版本5 (Graph Pad Software Inc.， La Jolla, CA)进行统计分析。采用双向方差分析(Bonferroni事后检验)检验组间差异是否显著。统计学意义定义为*p < 0.05或**p < 0.001。所有数据均以均数±标准误差表示，实验至少进行3个独立实验，每个实验重复3次。
摘要
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